任务二  灭菌技术

一、概述

灭菌对保证无菌制剂质量来说与无菌操作一样至关重要,是制备无菌制剂所必需的操作单元之一。

灭菌是指用物理或化学方法杀灭或除去一切微生物繁殖体及其芽孢的技术。灭菌法是指利用适当的物理或化学方法杀灭或除去活的微生物,从而使物品中残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。微生物的种类不同、灭菌方法不同,灭菌效果也不同。细菌的芽孢具有较强的抗热能力,因此灭菌效果常以杀灭芽孢为标准。

无菌操作法是将整个操作过程控制在无菌环境下进行操作的一种技术。

灭菌过程只是一个统计意义的现象,并不能达到绝对无菌。实际生产中,灭菌需将物料、制剂中微生物的概率下降至预期的无菌保证水平。由于灭菌的对象是药物制剂,许多药物不耐高温, 因此灭菌方法的选择应综合考虑制剂的性质、灭菌方法的有效性和经济性、灭菌后制剂的完整性和稳定性等因素。对微生物的要求不同亦可采用消毒、防腐等措施。

制剂制备中常用的灭菌法可分为物理灭菌法和化学灭菌法。一般可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法组合灭菌。只要物品允许,应尽可能选用最终灭菌法灭菌。若物品不适合采用最终灭菌法,可选用过滤除菌法或生产工艺达到无菌保证要求,只要可能, 应对非最终灭菌的物品作补充性灭菌处理(如流通蒸汽灭菌)。灭菌方法的分类如图4-5所示。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二、灭菌的可靠性参数

现行的无菌检验方法往往难以检出极微量的微生物,因此对灭菌方法的可靠性进行验证非常必要。F和F。值可作为验证灭菌可靠性的参数。

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                       D值与Z值

    1、D值  为微生物学耐热参数,是指一定温度下,杀灭90%微生物所需的时间,单位为min。D值越大,说明微生物耐热性越强。

    2、Z值   为灭菌的温度系数,是指某一特定微生物的D值减少到原来的1/10时所需升高的温度值,单位为°C。即灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度。如Z=10°C, 表示灭菌时间减少到原来灭菌时间的1/10(但具有相同的灭菌效果), 所需升高的灭菌温度为10°C。

    1.F值  为在一定灭菌温度(T)下给定Z值所产生的灭菌效果与参比温度(T₀)给定Z值的灭菌效果相同时, 所需的相应时间,单位为分钟。即整个灭菌过程效果相当于T₀温度下F时间的灭菌效果。如F=3, 表示该灭菌过程对微生物的灭菌效果,相当于被灭菌物品置于参比温度下灭菌3分钟的灭菌效果。F值常用于干热灭菌。

    2.F值  为在一定灭菌温度(T)、Z值为10℃所产生的灭菌效果与在121℃、Z值为10℃所产生的灭菌效果相同时所相当的时间,单位为分钟。F₀是将不同灭菌温度折算到相当于121℃湿热灭菌时的灭菌效力。即不管温度如何变化, t分钟内的灭菌效果相当于121℃下灭菌F₀分钟的效果。因此,F₀又称为标准灭菌时间。灭菌过程只需记录被灭菌物品的温度与时间,就可计算出F₀值,故用来验证灭菌效果有重要的意义。

三、物理灭菌法

  物理灭菌法是利用高温、滤过或紫外线等杀灭或除去微生物的方法。加热或遇射线可使微生物的蛋白质与核酸凝固、变性,从而导致微生物死亡。常用的物理灭菌法包括干热灭菌法、湿热灭菌法、射线灭菌法以及过滤除菌法。

  1.干热灭菌法  干热灭菌法是在干燥环境中通过加热进行灭菌的方法,包括火焰灭菌法和干热空气灭菌法。

  (1)火焰灭菌法 系指直接在火焰中灼烧灭菌的方法。该方法灭菌迅速、可靠、简便,适用于耐热材质(如金属、玻璃及陶器等)的物品与用具的灭菌,不适合药品的灭菌。

  (2)干热空气天菌法 系利用高温干热空气灭菌的方法。由于干热空气的穿透力较弱，故灭菌时间较长,常用的设备有干热灭菌柜、隧道灭菌器等。干热空气灭菌条件一般为160~170℃灭菌120分钟以上,170~180℃灭菌60分钟以上,250℃灭菌45分钟以上,也可使用其他温度和时间参数, 但应保证灭菌后的物品无菌保证水平( sterility assurancelevel，称SAL)≤10^-6 。250℃×45分钟的干热灭菌可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原物质。

  该法适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品灭菌,如玻璃器具、金属容器以及不允许湿气穿透的油脂类(如油性软膏基质、注射用油等)和耐高温的粉末化学药品的灭菌, 不适于橡胶、塑料及大部分制剂的灭菌。

2.湿热灭菌法  湿热灭菌法系利用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽灭菌的方法。由于蒸汽潜热大,穿透力强, 容易使蛋白质变性或凝固,故灭菌效率高,为制剂生产中最有效、应用最广泛的灭菌方法。药品、容器、胶塞以及其他遇髙温和潮湿不发生变化或损坏的物品, 均可采用本法灭菌。不适用于对湿热敏感的药品的灭菌。湿热灭菌法包括热压灭菌法、流通蒸汽灭菌法、煮沸灭菌法和低温间歇灭菌法

  (1)热压灭菌法 系指在密闭的高压蒸汽灭菌器内,利用高压饱和水蒸气来杀灭微生物的方法。热压灭菌条件通常采用121℃×15分钟、121℃×30分钟或116℃×40分钟,也可采用其他温度和时间参数,但应保证灭菌效果。热压灭菌具有灭菌可靠、效果好、易于控制等优点,能杀灭所有繁殖体和芽孢。适用于耐高温和耐高压蒸汽的制剂、玻璃容器、金属容器、瓷器等, 在注射剂生产中应用广泛。

  制剂生产中常用的热压灭菌设备为热压灭菌柜, 其结构主要由柜体、夹套、压力表、温度计、气阀、水阀、安全阀等组成。热压灭菌柜使用前需先开启夹层蒸汽阀及回汽阀, 使蒸汽通入夹套中加热,同时将待灭菌物品放入柜内并关闭柜门。当柜内温度、压力上升至工艺要求值时即为灭菌开始时间。待灭菌时间到达后, 先关闭总蒸汽和夹层进汽阀,排气至柜室压力降至零后再打开柜门,冷却后将灭菌物品取出。

为了保证灭菌效果, 热压灭菌柜使用时应注意以下问题。①必须使用饱和蒸汽。②使用前必须排净柜内空气,否则压力表上的压力是柜内蒸汽与空气两者的总压,而非单纯的蒸汽压力,温度达不到规定值。③灭菌时间应从全部药液真正达到所要求的温度时算起。④灭菌完毕后,必须使压力降到零后10~15分钟,再打开柜门。

(2)流通蒸汽灭菌法   系指在常压下,采用100℃流通蒸汽加热杀灭微生物的方法。一般灭菌的时间为30~60分钟, 但不能保证杀灭所有的芽孢。本法适用于不耐高温的制剂, 可作为不耐热无菌制品的辅助灭菌手段。

(3)煮沸灭菌法    系将待灭菌物品置于沸水中加热灭菌的方法。本法不能保证杀灭所有的芽孢, 常用于器具的灭菌。

(4)低温间歇灭菌法   是将待灭菌制剂于60~80℃加热60分钟,杀灭微生物的繁殖体后在室温放置24h,使其芽孢发育成繁殖体。按相同操作再进行第二次灭菌,反复多次,直至杀灭所有的芽孢为止。此法适用于不耐高温的物料和制剂的灭菌,但灭菌时间长、效率低、灭菌效果较差。

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                    影响湿热灭菌的主要因素

(1)微生物的种类与数量  不同的微生物或微生物的不同生长阶段对热的抵抗力相差较大,因此所需灭菌的温度与时间也不相同。芽孢的耐热性比繁殖期的微生物更强; 在同一温度下,微生物的数量越多,则所需的灭菌时间越长。

  (2)蒸汽性质  蒸汽包括饱和蒸汽、湿饱和蒸汽和过热蒸汽。饱和蒸汽含热量较高, 热穿透力较大,灭菌效率高; 湿饱和蒸汽因含有水分, 热含量较低,热穿透力较差, 灭菌效率较低。过热蒸汽温度虽高,但穿透力差,灭菌效率低。因此,热压灭菌应采用饱和蒸汽。

  (3)灭菌温度与时间  一般灭菌所需时间与温度成反比, 即温度越高,时间越短。但在设计灭菌温度和灭菌时间时必须充分考虑药物的稳定性, 既达到有效灭菌又不影响药物的治疗效果。对于耐热性药物可采取较高的灭菌温度,缩短灭菌时间,提高灭菌效率。

  (4)药物的性质 药液的pH值对微生物的生长、活力都有影响,一般情况下,微生物在中性环境中耐热性最强,在酸性中最差。

3.射线灭菌法 射线灭菌法为采用紫外线、辐射和微波杀灭微生物的方法,包括紫外线灭菌法、辐射灭菌法和微波灭菌法。

(1)紫外线灭菌法 是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。紫外线作用于核酸、蛋白质促使其变性, 同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧,从而共同杀菌作用。用于灭菌的紫外线一般波长为200~3000nm， 灭菌力最的是波长254nm。紫外线灭菌仅限于被照射物的表面, 其穿透能力较弱,不能透入溶液或固体深部,故只适于空气、物品表面灭菌,不适合药液、固体制剂深部的灭菌。

  (2)辐射灭菌法 是将待灭菌物品置于适宜放射源(如⁶⁰Co和¹³⁷Cs)辐射的y射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。辐射灭菌的主要灭菌参数为辐射剂量(指灭菌物品的吸收剂量),操作时应注意安全防护。该法具有不升高灭菌产品的温度, 穿透力强等特点,适用于医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及制剂的灭菌。

（3）微波灭菌法，是指用微波照射而杀灭微生物物方法。微波灭菌主要利用微波加热使微生物体内蛋白质变性或干扰微生物正常的新陈代谢达到灭菌的目的。微波灭菌具有低温、高效、经济、不污染环境、操作简单、易维护等特点，对热压灭菌不稳定的制剂可采取微波灭菌。

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紫外线灭菌应注意的问题

(1)紫外线灯管的杀菌力随着使用时间的延长而衰退，使用时间达到额定时间的70%时应更换灯管。

(2)紫外线的灭菌能力因细菌的种类不同而不同，而且灭菌效果与照射时间有关，应根据具体情况确定照射时间。

(3)紫外线的灭菌按照相对湿度60%设计，如湿度增大应相应地增加灭菌的照射时间。

(4)紫外线灯管的安装形式和高度应能保证灭菌效果。

(5)紫外线对人体有害，照射易发生红斑和皮肤灼烧

  4.过滤除菌法 过滤除菌法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法，常用于气体、热不稳定的药品溶液或原料的灭菌。制剂生产常用的滤器为0.22um的微孔滤膜，可分为亲水性和疏水性两种，滤膜材质应根据待过滤物的性质及过滤目的进行选择。采取过滤除菌法的无菌的产品应监控其生产环境的洁净度，在无菌环境下进行过滤操作，所用滤器及接受滤液的容器均须经121℃热压灭菌。

四、化学灭菌法

  化学药品杀灭微生物的方法，包括气体灭菌法和药液灭菌法。

  1、气体灭菌法   是指利用化学消毒剂的气体或蒸气杀灭微生物的方法。常用的化学消毒剂包括环氧乙烷、甲醛蒸汽、气态过氧化氢、臭氧等适用于在气体中稳定的物品灭菌，如医疔器械、塑料制品等。本法中最常用的气体环氧乙烷，一般与80%～9o%的惰性气体混合使用，在充有灭菌气体的高压腔室内进行。采用该法灭菌时应注意灭菌气体对物品质量的损害以及灭菌后的残留气体的处理。

  2.药液灭菌法   是指利用药液杀灭微生物的方法。常用的消毒液有0.1%～0.2%苯扎溴铵溶液，2%左右的酚或煤酚皂溶液，3%双氧水溶液、75%乙醇等。该法常应用于其他灭菌法的辅助措施，如皮肤、无菌器具的酒毒等。

五、无菌操作法

  无菌操作法指整个操作过程在无菌条件下进行的一种操作方法。本法适用于不能加热灭菌的无菌制剂，如注射用粉针剂、生物制剂、抗生素等。无菌分装及无菌冻干是最常见的无菌生产工艺。无菌操作所用的一切器具、物料以及操作环境必须进行灭菌，以保持操作环境的无菌。无菌操作可在无菌操作室或层流净化工作台中进行。

  1.无菌操作室的灭菌无菌操作室应定期进行灭菌，对于流动空气采用过滤介质除菌，对于静止环境的空气可采用灭菌方法。常用的无菌操作室空气灭菌方法有甲醛溶液加热熏蒸、过氧乙酸熏蒸、紫外线照射灭菌等。近年来利用臭氧进行灭菌，代替紫外线照射与化学试剂熏蒸灭菌，取得了令人满意的效果。除用上述方法定期对生产环境进行灭菌外，还需对无菌操作室内的地面、墙壁、设备、用具用75%乙醇、0.1%苯扎溴铵(新洁尔灭)、酚或煤酚皂溶液进行消毒，以保证操作环境的无菌状态。

  2.无菌操作操作人员进入无菌操作室之前应按规定洗净双手并消毒，换上已灭菌的工作服和专用鞋、帽、口罩等，头发不得外露并尽可能地减少皮肤外露。操作中所用到的物料、容器具应经过灭菌，制备少量无菌制剂时，宜采用层流洁净工作台。室内操作人员不宜过多，尽量减少人员流动，操作中严格遵守无菌操作室的工作规程。

六、无菌检查

  无菌检查法是用于检查要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原辅料等是否无菌的种方法。无菌检査法包括薄膜过滤法和直接接种法。

  薄膜过滤法取规定量的供试品经封闭式薄膜过滤器过滤后，取出滤膜在培养基上培养数日后观察是否出现浑浊或进行镜检。直接接种法将规定量供试品接种于培养基上，培养数日后观察培养基上是否出现浑浊或沉淀，与阳性和阴性对照品比较或培养液涂片、染色后用显微镜观察。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法直接接种法仅适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检査的供试品。

  无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境须达到无菌检查的要求，检验全过程应按照无菌操作，防止微生物的污染。无菌检查可在洁净度B班固量王他国囫地里自遮空气区域，内或隔离系堑(层流洁净工作回国中进行。无菌检查结果的判断、，应依据《中国药典2015年版)规定的标准加以判断。