微生物生长的测定

微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体的生长很难测定，而且也没有什么实际应用价值。因此，在微生物学的研究和应用中，通常是测定群体的增加量，即群体的生长。

通过对微生物生长的测定，可以客观地评价培养条件、营养物质对微生物生长的影响，或评价抗菌物质对微生物的抑制或杀死效果，或客观反映微生物的生长规律。

测定不同种类、不同生长状态微生物的生长情况，需要选用不同的指标。

单细胞微生物 → 测定细胞数目或测定生长量；

多细胞微生物(尤其是丝状真菌) → 测定生长量或测定菌丝长度。

测定微生物细胞数目的方法

1.显微镜直接计数法（参考教材P349-P350）

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接观察、计数的方法。

常用计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，其中血球计数板较厚，不能使用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞、霉菌孢子等的计数，而后两种计菌器较薄，可用油镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 

优点：操作简便、快速、直观。

缺点：所测结果是总菌数。若改进为染色后计数，则可分别测得活菌数和死菌数。例如，用美蓝染液对酵母菌染色，活细胞为无色，死细胞为蓝色；又如，细菌经吖啶橙染色，在紫外光显微镜下活细胞橙色荧光，死细胞绿色荧光。

血球计数板计数法较常用，其主要操作是：将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的(0.1 mm3)，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物的总数目。 

2.平板菌落计数法（参考教材P350-P352）

平板菌落计数法适用于各种好氧微生物和部分厌氧微生物，其主要操作是：把稀释后的一定量菌样通过倾注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上（内），待培养后，每一活细胞就形成一个单菌落，此即“菌落形成单位”（CFU），根据每皿上形成的CFU数乘上稀释度就可推算出菌样的含菌数。

此法最为常用，但操作较烦琐且要求操作者技术熟练。为克服此缺点，国外已出现多种微型、商品化的用于菌落计数的小型厚滤纸片或密封琼脂片等。(参考教材P351)

平板菌落计数法是一种活菌计数法，可以直接反映出样品中活细胞的数量，因此被广泛应用于生物制品（如活菌制剂）、食品、饮料、水（包括水源水）以及多种产品的质量检测与控制的标准方法中。

自动细菌平板稀释仪和自动菌落计数仪等先进设备的应用则可以提供更快速、准确的计数结果。(参考教材P352) 

平板菌落计数法的应用--GB4789.2-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定

3.最大可能数计数法（参考教材P353）

最大可能数(MPN)计数法，又称液体稀释法、稀释培养法，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物是否存在及其数量。

MPN计数法的主要操作是：对未知菌样作连续的10 倍梯度稀释。根据估计数，从最适宜的3个连续的10倍稀释液中各取5ml试样，接种到3 组共15 支装有培养液的试管中(每管接入1 mL)。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN表，再根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。 

MPN法的应用--GB4789.3-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数

4.光电比浊计数法（参考教材P353）

光电比浊计数法是测定无色菌悬液中总细胞数的一种快速方法。其原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度（O.D.）成正比，与透光度成反比。可用透光度或光密度表示菌悬液的浓度。

光电比浊计数法主要操作是：借助于分光光度计在一定波长（450 nm～650 nm）下首先对一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，之后以光密度值为纵坐标，每毫升菌液细胞数为横坐标制作标准曲线，最后测定待测菌悬液的光密度，对照标准曲线求出菌液浓度。 

优点：简便、快速、不干扰或不破坏样品。

缺点：灵敏度较差。

局限性：只适用于培养液颜色浅，无混杂其他物质的样品。若培养液的颜色较深则会影响到测定结果。 

5.薄膜计数法（参考教材P351-P352）

薄膜计数法，也称滤膜法，常用于测定量大、含菌浓度低的流样样品（如水、空气等）。

其主要操作是将定量的待测样品通过微孔滤膜过滤器，微生物被阻留在滤膜表面上，将此滤膜放在适当的固体培养基上培养，计算其上长出的菌落数即可求出样品中所含的菌数。

薄膜计数法也可用于含杀菌抑菌成分的药物样品，此类药品进行薄膜计数时，需要过滤并用无菌冲洗液去除杀菌抑菌成分，再将滤膜置于培养基上培养，即可使药品中所含微生物被定量检出。 

测定微生物生长量的方法

1.测体积法

测体积法是一种粗放的方法，用于初步比较。

常用操作方法：把待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察其体积。

2.称重量法

称质量法包括湿重法和干重法，适用于菌体浓度较高的样品，并要求除尽杂质。微生物的干重一般为其湿重的10％～20％。

湿重法较粗放、简便，其操作是将一定量的微生物培养液通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤后收集菌体，直接称重。

干重法是将离心或过滤后得到的湿菌体干燥后称重的方法。干燥温度可采用105℃、100℃或红外线烘干,也可在较低的温度（80℃或40℃）下进行真空干燥，然后称干重。

一个细菌细胞约重10-12 g～10-13g。

3.生理指标法

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度、发酵液中的含氮量、含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。

(1)含氮量测定法

(2)含碳量测定法

(3)DNA含量测定法

(4)其他生理指标法

4.丝状微生物菌丝长度的测定

常用方法：

1. 测定一定时间内琼脂培养基表面菌落直径的增加值

2. 测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向前延伸的距离（如食用菌栽培）

3. 测定在一定时间内单个菌丝的伸长长度（借助目镜测微尺）