题目

实验一  环境中微生物的检测

实验二  普通光学显微镜的使用及细菌形态的观察              （3学时）

详细内容

目的：证明实验室环境与体表存在微生物，比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型，观察不同类群微生物的菌落形态特征，体会无菌操作的重要性。学习并掌握油镜的使用技术。观察细菌的个体基本形态。

重点：学会显微镜的使用

难点：熟练地使用油镜观察到细菌的形态

内容：

实验一  环境中微生物的检测

微生物无缝不钻，无孔不入。学生刚刚接触微生物实验，必须建立“处处有菌”的观念，牢固树立无菌概念，经常保持台面及周围环境的清洁，认真掌握各种操作技术，避免杂菌的污染，这是保证实验成功的必要条件。

平板培养基含有微生物生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1～2d内每一菌体即能通过多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称菌落。每一种细菌所形成的菌落都具有它自己的特点，如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等，因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

实验二  普通光学显微镜的使用及细菌形态的观察

显微镜是研究微生物所必不可少的工具。微生物学实验室中最常用的是普通光学显微镜，无论是观察微生物的个体形态还是测量微生物细胞的大小都必须使用它。因此，我们应了解显微镜的构造和原理，以达到正确使用和保奍的目的。

一.普通光学显微镜的基本结构

普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分组成。

1.机械装置

1)镜座和镜臂：是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微镜的作用。

2)镜筒：是一个金属圆筒，其上端安放目镜，下端安装转换器，镜筒的长度是固定的，通常为160mm。有些显微镜的镜筒长度是可调节的。

3)转换器：是一个用于安装物镜的圆盘，其上可装3～4个物镜。为使用方便，物镜应按低倍到高倍的顺序安装。转换物镜时，必须用手按住圆盘旋转，勿用手指直接推动物镜，以免使物镜和转换器间的螺旋松脱而损坏显微镜。

4)镜台：用于安放镜片。其上有玻片夹或玻片移动器以及刻度标尺。

5)调焦装置：含粗螺旋和细螺旋，用于调节物镜和标本间的距离。粗螺旋旋转一圈可使镜筒升降约10mm，细螺旋旋转一圈可使镜筒升降0.1mm的距离。

2.光学系统

（1）目镜：其功能是把物镜放大的物像再次放大，有5×、10×、16×等几种。

（2）物镜：是显微镜中最重要的部件。通常有低倍（4×）、中倍（10～16×）、高倍（40×）和油镜（100×）等几种配置。

（3）聚光器：可聚光线，上下移动，在其边框上刻有数值孔径值。

（4）反光镜：可采集光线，并将光线射向聚光器。

二．油镜的工作原理

光学显微镜的物镜直接影响显微镜的分辨率，在几种配置的物镜中，油镜的放大倍数最大。与其他物镜相比，油镜的使用也比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加镜油，这主要是因为：

1.增加透明亮度

油镜的放大倍数可达100×，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n＝1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率n＝1.52）。

2.增加显微镜的分辨率

显微镜的分辨率或分辨力是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：

        分辩率（最大可分辨距离）＝λ/2NA

式中λ＝光波波长；NA＝物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4～0.7μm）,而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA＝n•sinα。

式中α为光线最大射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120°，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径（NA一般在1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。

3.指导：

实验一：

1.用记号笔在培养皿底部注明组别和处理方法。

2.处理

1)肉膏蛋白胨琼脂平板一：放在室外把盖子打开，暴露半小时。

2)肉膏蛋白胨琼脂平板二：放在室内把盖子打开，暴露半小时。

3)肉膏蛋白胨琼脂平板三：将平板分成四部分，并用记号笔标明。

◆ 用手指在“皮肤”处按一下；

◆ 将人民币一角在“纱票”处按一下；

 ◆ 以无菌棉签从牙中取牙垢，涂于“牙垢”处；

◆ 以无菌棉签从鼻腔中取少许分泌物涂于“鼻腔”处；

此外，还可以检查其他许多项目，自己根据情况可以选定。

4)马铃薯琼脂平板一：放在室外把盖子打开，暴露半小时。

5)马铃薯琼脂平板二：放在室内把盖子打开，暴露半小时。

3.培养

（1）将肉膏蛋白胨琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37℃恒温培养箱，培养1～2d。

（2）将马铃薯琼脂平板翻转，使皿底朝上，放28℃恒温培养箱，培养一周。

实验报告

将以上结果列表并加以说明：为什么我们在进行微生物学实验时要强调无菌操作。

实验二：

1.观察前的准备

◆ 显微镜的放置

◆ 调节光源

2.低倍镜观察

3.高倍镜观察

4.油镜观察

（1）用粗调节器将镜筒提起约2厘米，将油镜转至正下方。

（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

（3）从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不要压在标本上，更不能用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。

（4）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物象为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而未见物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物象看清为止。

（5）用同样的方法观察其他各菌标本。

（6）观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后现蘸取少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其它纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。

（7）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。

5.（奋森氏）螺旋体标本的制作

（1）染色液：

水溶性黑色素B(Nigrosin B)  10克

蒸馏水                     90毫克

溶解后煮沸30分钟，再加入甲醛0.5毫升，用滤纸过滤后使用。

（2）制片：

在玻片上，以染色液一滴与标本（牙垢）混合均匀，制成涂片，干燥后用油镜检查。螺旋体不着色，背景为黑色。

实验报告

1.简述油镜的使用方法和注意事项。

2.绘出你所观察到的细菌形态。

4.素材：

实验一：

1.培养基  

肉膏蛋白胨琼脂平板（每人三个平皿）

马铃薯琼脂平板（每人二个平皿）

2.仪器和其他用具

无菌棉签（装在试管内）  记号笔

实验二

1.菌种：

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

四联球菌

产气杆菌

螺旋体

2.溶液或试剂 ：香柏油  二甲苯

3.仪器或其他用具：显微镜  擦镜纸等