题目

实验三  细菌的涂片及单染色法

实验四  细菌的革兰氏染色法                                （3学时）

详细内容

目的：学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法及无菌操作技术。巩固显微镜（油镜）的使用方法。学习并掌握革兰氏染色的原理和方法。

重点：学会细菌染色方法

难点：细菌的革兰氏染色

内容：

实验三  细菌的涂片及单染色法

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。通常作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

实验四  细菌的革兰氏染色法

革兰氏染色法是丹麦病理学家Christain Gram创立的。其法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染液结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染液（番红或沙黄）复染。经此方法染色后，细胞保留初染液蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染液被脱色而使细菌染上复染液的颜色（红色），该菌则属于革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染液的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细胞的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染液的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁的肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染液复染后，细胞被染上复染液的红色。

指导：

实验三：

1.涂片

取干净载片，滴一小滴蒸馏水（或用接种环挑1～2环水）于载片中央，用无菌接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm2。

注意：载玻片应洁净无油腻；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。

2.干燥

室温自然干燥。

3.固定

手执风干的玻片一端，有菌膜的面朝上，以钟摆速度通过火焰3～4次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。

固定的目的：杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；增加菌体对染料的亲和力。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。

注意：热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。

1.染色

将固定好的涂片冷却后，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间1～2min。

金黄色葡萄球菌用石碳酸复红染色，大肠杆菌用草酸铵结晶紫染色液（吕氏碱性美蓝染液）染色。

2.水洗

倾去染液，用自来水冲洗，自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水无色为止（可使背景不着色）。

注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

3.干燥

自然干燥，或用吸水纸吸干（勿擦去菌体）。

4.镜检

涂片必须完全干燥后才能用油镜观察（水的折射率与香柏油的折射率不同）。

实验报告

绘图记录你所观察到的各种菌体形态，同时标明菌体名称、染色液名称、菌体颜色。

实验四：

1．涂片

取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

注意：要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不易过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不易过热（以玻片不烫手为宜）。

2.初染

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2min，水洗。

3.媒染

滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

4.脱色

将载片上的水甩净、倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时止，约20～30秒，立即水洗。

注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握乙醇的脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。

1.复染

用沙黄液染1～2min，水洗。

2.镜检

干燥后，置油镜观察。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

3.混合涂片对比

按上述方法，在同一张载片上以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。

实验报告

◆ 绘图说明你所观察到的革兰氏染色的结果。

◆ 在革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果，为什么？

4.素材：

实验三

1.菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

2.染色液：草酸铵结晶紫染色液（吕氏碱性美蓝染液），石碳酸复红

3.仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸，蒸馏水，火柴等。

实验四

1.菌种： 大肠杆菌（培养约24h）一支

         金黄色葡萄球菌（培养约24h）一支

2.仪器：显微镜

3.染色液：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液

4.材料：载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸等