题目
实验五 细菌的芽胞染色法
实验六 细菌的荚膜染色法 （3学时）
详细内容
目的：学习并掌握芽孢染色法，观察芽孢的形态特征。学习并掌握细菌的荚膜染色法，观察荚膜的形态特征。
重点：学习并掌握芽孢染色法
难点：芽孢染色法
内容：
实验五 细菌的芽胞染色法
芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
实验六 细菌的荚膜染色法
荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染液的亲和力弱，不易着色，而且易溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上（高），制片时通常不用热固定，以免荚膜皱缩变形，影响观察。
指导：
实验五
一、改良的Schaeffer-Fulton氏染色法
1．制备菌悬液
加1～2滴水于小试管中，用接种环挑取2～3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。
注意：所用菌种应掌握菌龄（枯草杆菌培养24小时），以大部分细菌已形成芽孢囊为宜；取菌不宜太少。
2．染色
加孔雀绿染液2～3滴于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15～20分钟。
3．涂片固定
用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰三次温热固定。
4．脱色
水洗，直至流出的水无绿色为止。
5．复染
用番红染液染色2～3分钟，倾去染液并用滤纸吸干残液。
6．镜检
干燥后用油镜观察。
芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。
二、Schaeffer-Fulton氏染色法
1．制片
按常规涂片、干燥、固定。
2．染色
加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载片一端，在微火上加热至染液冒蒸气并开始计时，维持5分钟。
注意：加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干燥。
3．水洗
待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。
注意：勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。
4．复染
用番红染液染色2分钟。
5．水洗
用缓流冲洗后，吸干。
6．镜检
干后用油镜观察。
芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。
实验报告
1．绘图表示芽孢杆菌的形态特征（芽孢形状、着生位置及芽孢囊的形态特征）
2．用Schaeffer-Fulton氏染色法加热染色时，若因一时疏忽，玻片上的染液被烘干，此时能否立即补加染液？为什么？
实验六
一、湿墨水法
1．制备菌和墨水混合液
加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。
2．加盖玻片
将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。
注意：加盖片时勿留气泡，以免影响观察。
3．镜检
用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。
背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。
二、干墨水法
1．制混合液
加一滴6%葡萄糖液于洁净载玻片的一端，然后挑取少量菌体与其混合，再加一环墨水，充分混匀。
注意：玻片必须洁净无油迹，否则，涂片时混合液不能均匀散开。
2．涂片
另取一端边缘光滑的载玻片作推片，将推片一端的边缘置于混合液的前方，然后稍向后拉，当推片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿推片接触的后缘散开，尔后以大约30°角迅速将混合液推向玻片另一端，使混合液铺成薄层。
3．干燥
空气中自然干燥。
4．固定
用甲醇浸没涂片固定一分钟，倾去甲醇。
5．干燥
在酒精灯上方用文火干燥。
6．染色
用甲基紫染色1～2分钟。
7．水洗
用自来水轻轻冲洗，自然干燥。
8．镜检
用低倍镜和高倍镜观察。
背景灰色，菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈为荚膜。
三、Anthony氏法
1．涂片
按常规取菌涂片。
2．固定
空气中自然干燥，不可加热干燥固定。
3．染色
用1%的结晶紫水溶液染色2分钟。
4．脱色
以20%的硫酸酮水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。
5．镜检
干后用油镜观察。
菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。
四、复红墨水染色
◆ 取固氮菌涂片、风干、不加热固定。
◆ 用石碳酸复红染色1分钟，倾去多余染液水洗。
◆ 在涂片一端加1%墨素一滴，另取一边缘平滑的载玻片，轻轻将墨素刮过涂布面使成一薄层干燥，不用火。
◆ 油镜检查
实验报告
绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。
4.素材：
实验五
1.菌种： 青虫杆菌
枯草芽孢杆菌
2.染色液：5%孔雀绿水溶液， 番红水溶液
3.仪器或其他用具：小试管，滴管，烧杯，试管架，木夹子，显微镜等
实验六
1．菌种：胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus,即钾细菌）或褐球固氮菌（Azotobacter chroococcus）约2天的无氮培养基琼脂斜面培养物（阿须贝）
2．染色液：绘图墨水，用滤纸过滤后贮藏于瓶中备用。6%葡萄糖水溶液；1%甲基紫水溶液；1%结晶紫水溶液；20%硫酸酮水溶液；甲醇；石碳酸复红染液等。
3．仪器或其他用品：载玻片，盖玻片，滤纸，显微镜等。
