题目 

实验七  细菌的鞭毛染色法

实验八  细菌活体运动性的观察                              （3学时）

详细内容

目的：学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法，了解细菌鞭毛着生情况。掌握悬滴法和压片法观察细菌运动的基本技术。学会在显微镜下辨别细菌的运动性和非运动性。

重点：鞭毛染色

难点：鞭毛观察

内容：

实验七  细菌的鞭毛染色法

细菌的鞭毛非常纤细，其直径一般为10～20纳米，只有用电子显微镜才能观察到。为了使鞭毛能在光学显微镜下被观察到，就需要用特殊的染色法，该染色法是在染色前用媒染剂处理，使它堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径，然后再进行染色，以便使鞭毛的直径粗细达到光学显微镜的分辨力限度以内。

实验八  细菌活体运动性的观察

在显微镜下观察细菌的运动性，可初步判断细菌是否有鞭毛。观察时，要适当减弱光强度以增加反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以区分。

悬滴法就是将菌液加在洁净的盖玻片中央，在其周围涂上凡士林，然后将它覆盖在凹玻片上，使菌液对准凹槽中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。

压片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。

大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌的螺菌都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用细龄菌。

指导：

实验七

1．菌种的准备

用新培养的菌种为宜。一般用新制备的斜面（培养基表面湿润，斜面基部有冷凝水）接种后培养10小时。如所用菌种已长期未移种，则最好用新制备的斜面连续移种2～3次（以增强细菌的活动力）后再使用。

注意：良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛易脱落。

2．清洗玻片

选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用的金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）中，煮沸20分钟。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干。再放入浓洗液中浸泡5～6天。使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水，过火去乙醇，立即使用。

注意：玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开）。

3．菌液的制备

取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1～2 ml无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果不如先制备菌液。

注意：挑菌时尽量不带培养基。

4．制片

取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余的菌液，室温空气中自然干燥。

注意：干后应尽快染色，不宜放置时间过长。

5．染色

涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3～5分钟，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1分钟，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。

注意：配制合格的染色液（尤其是B液），充分洗去A液再加B液，掌握好B液的染色时间均是鞭毛染色成败的重要环节。

6．镜检

干后用油镜观察。观察时可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛。

菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪状。

实验报告

绘图表示鞭毛细菌的形态特征。

实验八

一、悬滴法

1．制备菌液

从幼龄菌斜面上，挑取数环菌于盛有1～2 ml无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。

2．涂凡士林

取洁净凹玻片或盖玻片，在其四周涂少许凡士林。

3．滴加菌液

在盖玻片中央滴一小滴菌液。为了便于观察时寻找菌液的位置，可用记号笔在菌液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央。

4．盖凹玻片

将凹玻片的凹槽对准盖玻片中心的菌液，并轻轻盖在盖玻片上，轻轻按压使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位于凹槽中央。

注意：若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上面影响观察。

5．镜检

先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜观察，盖玻片厚度不能超过0．17mm，并要十分小心，以免压碎盖玻片，损坏镜头。

注意：观察过程要在略暗光线下进行。

二、压片法

1．制片

在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0．01%的美蓝水溶液与其混合均匀（这种稀释染料不会把细菌杀死，却会把细菌染上淡淡的颜色，增加细菌与背景的对比，观察起来比较容易）。用镊子取一洁净盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运动。

2．镜检

先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚度不能超过0．17mm。观察时，要用略暗光线。

有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的移位而与布朗运动或随水流动相区别。

实验报告

记录你所观察到的细菌的运动方式以及运动幅度，并以此判定细菌的鞭毛有无。

4.素材：

实验七

1．菌种：苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，普通变形杆菌(Proteus vulgaris)斜面菌种（菌龄在15～18小时）

2．染色液：硝酸银鞭毛染色液（A、B液）

A液：丹宁酸5g ,FeCl31.5g ,蒸馏水100ml。待溶解后，加入1%NaOH溶液1ml和15%的甲醛溶液2ml。

B液：硝酸银2g，蒸馏水100ml。

待硝酸银溶解后，取出10ml做回滴用。往90mlB液中滴加浓氢氧化铵溶液，当出现大量沉淀时再继续加氢氧化铵，直到溶液中沉淀刚刚消失变澄清为止。然后用留的10mlB液小心地逐滴加入，至出现轻微和稳定的薄雾为止（此操作非常关键，应格外小心）。在整个滴加过程中要边滴边充分摇荡。配好的染色液当日有效，4小时内效果最好。

3．仪器或其他用品：载玻片，盖玻片，显微镜，接种环，吸水纸，擦镜纸，等。

实验八

1．菌种：金黄色葡萄球菌，青虫杆菌，变通变形杆菌（15～18小时），铜绿假单胞菌（14～18小时）

2．仪器或其他用品：凹玻片，盖玻片，镊子，牙签，接种环，滴管，擦镜纸，凡士林等