题目
实验九 放线菌的形态观察
实验十 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
实验十一 霉菌的形态观察 （3学时）
详细内容
目的：学习并掌握观察放线菌形态的基本方法；初步了解放线菌的形态特征。观察酵母菌的形态及出芽生殖方式工，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。学习并掌握观察霉菌形态的基本方法，了解四类常见霉菌的基本形态特征。
重点：掌握放线菌、酵母菌、霉菌的制片方法
难点：学会酵母菌死活细胞的鉴定方法
内容：
实验九 放线菌的形态观察
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝（基丝），基丝生长到一定的阶段还能向空气中生长出气生菌丝（气丝），并进一步分化形成孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝，在显微镜下直接观察时，气丝在上层，基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生，在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。为了观察放线菌的形态特征，人们设计了各种培养和观察的方法，这些方法的主要目的是为了尽可能地保持放线菌在自然生长状态下的形态特征。
插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检，这种方法可观察到放线菌在自然状态下生长的特征，而且便于观察不同生长期的形态。
玻璃纸法：玻璃纸是一种透明的半透膜，将灭菌的玻璃纸覆盖在琼脂平板表面，然后将放线菌接种于玻璃纸上，经培养，放线菌在玻璃纸上形成菌苔。观察时，揭下玻璃纸，固定在载玻片上直接镜检。这种方法既能保持放线菌的自然生长状态，也便于观察不同生长期的形态特征。
印片法：将要观察的放线菌的菌落或菌苔，先印在载玻片上，经染色后观察。这种方法主要用于观察孢子丝的形态、孢子的排列及其形状等。方法简便、但形态特征可能有所改变。
实验十 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。但美蓝浓度、作用时间等均有影响，应加注意。
实验十一 霉菌的形态观察
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3～10μm），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。又由于霉菌菌丝较粗大，细胞容易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。
直接制片观察法：是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。用此染色液制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散；溶液本身呈蓝色，有一定染色效果，能增强反差。必要时，还可用树胶封固，制成永久标本长期保存。
载玻片培养观察法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿着盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。
指导：
实验九
一、插片法
1．倒平板
取融化并冷至大约50℃的高氏1号琼脂约20ml倒平板，凝固待用。
2．接种
用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。
注意：划线要密些，以利插片。
3．插片
以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约45°角插入琼脂内（插在接种线上），插片数量可根据需要而定。
4．培养
将插片平板倒置，28℃培养，培养时间根据观察的目的而定，通常3～4天。
5．镜检
用镊子小心拨出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。
注意：观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当的视野，再换高倍镜观察。如果用0．1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。
二、玻璃纸法
1．倒平板
取融化并冷至大约50℃的高氏1号琼脂约20ml倒平板，凝固待用。
2．铺玻璃纸
以无菌操作用镊子将已灭菌（155～160℃干热灭菌2小时）的玻璃纸片（似盖玻片大小）铺在培养基琼脂表面，用无菌玻璃涂棒（或接种环）将玻璃纸压平，使其紧贴在琼脂表面，玻璃纸和琼脂之间留气泡。每个平板可铺5～10块玻璃纸。
也可用略小于平皿的大张玻璃纸代替小纸片，但观察时需要再剪成小块。
3．接种
用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在玻璃纸上划线接种。
4．培养
将平板倒置，28℃培养3～5天。
5．镜检
在洁净载玻片上加一小滴水，用镊子小心取下玻璃纸片，菌面朝上放在玻片的水滴上，使玻璃纸平贴在玻片上（中间勿留气泡），先用低倍镜观察，找到适当视野后换高倍镜观察。
注意：操作过程，勿动玻璃纸菌面上的培养物。
三、印片法
1．接种培养
用高氏1号琼脂平板，常规划线接种或点种，28℃培养4～7天。也可用上述两种方法所使用的琼脂平板上的培养物，作为制片观察的材料。
2．印片
用接种铲或解剖刀将平板上的菌苔连同培养基切下一小块，菌面朝上放在一载玻片上。另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢子）粘附（“印”）在后一块载玻片的中央，有印迹的一面朝上，通过火焰2～3次固定。
注意：印片时不要用力过大压碎琼脂，也不要错动，以免改变放线菌的自然形态。
3．染色
用石炭酸复红覆盖印迹，染色约1分钟后水洗，晾干（不能用吸水纸吸干）。
4．镜检
干后用油镜观察。
实验报告
绘图说明你所观察到的放线菌的主要形态特征。
实验十
一、美蓝浸片的观察
1.制片
在载玻片的中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量的酵母菌苔放在染液中，混合均匀。
注意：染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。
2.盖片
用镊子取一盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
注意：盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
3.镜检
将制片放置约3分钟后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
4.对比观察
染色约0.5小时后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。
5.对比实验
用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。
二、水—碘液浸片的观察
在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水—碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
实验报告
1.绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
2.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。
实验十一
一、直接制片观察法
在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。
注意：挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。
二、载玻片培养观察法
1.培养小室的灭菌
在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，包扎后于121℃灭菌30min，烘干（60℃）备用。
2.琼脂块的制作
取已灭菌的马鈴薯琼脂（或察氏琼脂）培养基（试管中60℃水浴中融化保温）6～7ml注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.5～1cm2的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块）。
注意：制作过程应注意无菌操作。
3.接种
用尖细的接种针挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。
注意：接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块的边缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察。
4.培养
先在平皿的滤纸上加3～5ml灭菌的20%甘油（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖，28℃培养。
5.镜检
根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。
实验报告
绘图说明你所观察的霉菌形态特征，并比较酵母菌和细菌、放线菌和霉菌在形态上的异同。
4.素材：
实验九
1．菌种：细黄链霉菌5406或青色链霉菌等
2．培养基：灭菌的高氏1号琼脂培养基
3．仪器或其他用具：经灭菌的：平皿、玻璃纸、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，刀片，石炭酸复红染色液，显微镜等。
实验十
1.菌种：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)培养约2d的麦芽汁（或豆芽汁）斜面培养物。（热带假丝酵母？）
2.染色液：0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液。
3.仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片等。
实验十一
1.菌种：曲霉（Aspergillus sp.）,青霉，根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培养2～5天的马铃薯琼脂平板培养物。
1.培养基：土豆琼脂或察氏琼脂
2.染色液：乳酸石炭酸棉蓝染色液
3.仪器或其他用具：无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，U形玻棒，解剖针，解剖刀，镊子，50%乙醇，20%的甘油以及显微镜等。
