题目
实验十四 培养基的制备与灭菌
详细内容
目的：掌握培养基的配制原理、方法以及高压蒸汽灭菌技术，并为下一个实验做好准备。
重点：学会配制培养基的方法
难点：掌握高压蒸汽灭菌技术
内容：
实验十四 培养基的制备与灭菌
培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养物质，其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因素以及水分等。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性（嗜碱细菌和细菌例外）。甩以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
根据微生物的种类和实验目的的不同，培养基的类别可分为：
一、按成分不同：天然培养基，合成培养基，半合成培养基。
二、按培养基的物理状态：固体培养基（琼脂占1.5～2.5%），半固体培养基（琼脂占0.2～0.7%），液体培养基。
三、按培养基的用途：基础培养基，营养培养基（加富培养基），鉴别培养基，选择培养基。
由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。
注意：琼脂不是营养物质，而是凝固剂。它是由石花菜等红藻加工制成的胶体物质，其主要万分是半乳糖和半乳糖醛酸的聚合物，一般不能被微生物所利用，仅起凝固剂作用。这种胶体物质在水中加热到96℃～100℃熔化，45℃以下即凝固。只有少数细菌能溶解琼脂，因此它是应用最广泛的凝固剂。但多次反复熔化，其凝固性降低。硅胶仅适用于配制自养微生物生长的固体培养基。
指导：
1.称量
按照培养基配方正确称量各种成分，放于烧杯中。
2.熔化
向上述烧杯中加入所需要的水量，搅匀，然后加热使其熔解，如是配制固体培养基，在琼脂熔化的过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水份。如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌后加足水份及其他药品，待完全熔化后，补足所失水分。
3.调pH值
初制备好的培养基往往不能符合所要求pH值，故需用pH试纸或酸度计矫正。用1NHCl或1NaOH调pH至所需范围。
4.过滤
用滤纸或多层纱布过滤。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。
5.分装
根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶中，管（瓶）口塞上棉塞。
注意：不要使培养基沾染管（瓶）口上，以免浸湿棉塞，引起污染。
液体：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
固体：分装试管 ，其装量为管高的1/5，灭菌后制成的斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。
半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。
6.灭菌
培养基分装好以后，塞上棉塞，外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成分。培养基经灭菌后，必须放37℃温室中培养24小时，无菌生长者方可使用。
附各种培养基配方及制法：
一、糖发酵培养基（每2人一组，每组共6支试管。其中3支是加装葡萄糖；另3支是加装乳糖）。总量1000ml （18×6=108支试管）
配方：
蛋白胨 10克
NaCl 5克
水 1000ml
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1～2ml
pH 7.6
另配20%糖溶液（葡萄糖、乳糖）各10ml
制法：
1.将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH7.6）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（杜氏小管），使充满培养液。
2.将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121℃灭菌20分钟；糖溶液112℃灭菌30分钟。
3.灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0.5ml（按每10ml培养基中加入20%的糖液0.5ml，则成1%的浓度）。
4.配制用的试管必须干净，避免结果混乱。
二、H2S试验用培养基 总量500ml （18×2=36支试管）
配方：
蛋白胨 10克
NaCl 2.5克
柠檬酸铁铵 0.25克
Na2S2O3 0.25克
琼脂 8～10克
蒸馏水 500ml
pH 7.2
制法：
先将琼脂、蛋白胨熔化，冷至60℃加入其它成份。分装试管，112℃灭菌, 15～20分钟，备用。
三、蛋白胨水培养基（吲哚试验） 总量500ml （18×2=36支试管）
配方：
蛋白胨 5克
NaCl 2.5克
水 500ml
pH 7.6
制法：
配制蛋白胨水培养基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。
121℃灭菌，20分钟。
四、明胶培养基（明胶液化试验）总量600ml (18×3=54支试管)
配方：
牛肉膏 1.8克
蛋白胨 6克
NaCl 3克
明胶 72～108克
水 600ml
pH 7.2～7.4
制法：
在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。溶化后调pH 7.2～7.4。112℃灭菌20分钟。
五、葡萄糖蛋白胨水培养基（V.P反应，甲基红试验）总量1000ml (18×4=72支试管)
配方：
蛋白胨 5克
葡萄糖 5克
K2HPO4 2克
蒸馏水 1000ml
pH 7.0～7.2
制法：
将上述各成分溶于1000ml水中，调pH 7.0～7.2，过滤。分装试管，每管约10ml，112℃灭菌30分钟。
六、柠檬酸盐培养基
配方
NH4H2PO4 1克
K2HPO4 1克
NaCl 5克
MgSO4 0.2克
柠檬酸钠 2克
琼脂 15～20克
蒸馏水 1000ml
1%溴香草酚蓝乙醇溶液 10ml
制法
将上述各成分加热溶解后，调pH6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管，121℃灭菌20分钟后制成斜面。注意配制时控制好pH，不要过碱，以黄绿色为准。
七、淀粉培养基 总量500ml（大三角瓶倒平板18×1=18个平板）
配方
蛋白胨 5克
NaCl 2.5克
牛肉膏 2.5克
可溶性淀粉 1克
蒸馏水 500ml
琼脂 7.5～10克
制法
121℃灭菌20分钟
4.素材：
1.溶液和试剂
进行生理生化反应所用的培养基所需药品。
（1）糖发酵培养基
（2）H2S试验用培养基
（3）蛋白胨水培养基（吲哚试验）
（4）明胶培养基（明胶液化试验）
（5）葡萄糖蛋白胨水培养基（V.P反应，甲基红试验）
（6）柠檬酸盐培养基
（7）淀粉培养基
2.仪器或其他用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，皮套，纱布等。
