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2 练习
内容
菌种鉴定工作的步骤：
◆ 获得该微生物的纯培养物
◆ 测定一系列必要的鉴定指标
◆ 查找权威性的菌种鉴定手册
经典分类鉴定方法
(一) 形态特征：包括个体形态和群体形态(即培养特征)
◆ 在显微镜下观察细胞的形状、大小及排列情况，革兰氏染色反应，有无运动，鞭毛着生位置和数目，芽孢的有无及芽孢着生的部位和形状，细胞内含物，个体发育过程中形态变化的规律性。
◆ 在固体培养基上观察菌落的形状、大小、颜色、光泽、粘稠度、隆起形状、透明度及边比重特征，和水溶性色素、质地、移动性、气味等。
◆ 在半固体培养基中观察穿刺接种后的生长及运动情况。
◆ 在液体培养基中观察生长特征，液体是否混浊及混浊的程度；液面有无菌膜；管底有无沉淀以及沉淀的形状；管中有无气泡；培养液中有无颜色变化等。
(二) 生理生化特性
◆ 营养要求：可根据微生物对营养的不同利用能力来区别微生物。试验多种营养能否被微生物作为碳源和能源利用，以及微生物对一定有机化合物或CO2的利用能力。对于氮源来讲，看其是取自蛋白质、蛋白胨、氨基酸或铵盐、硝酸盐，还是大气中的游离氮。
◆ 代谢产物：不同的微生物，因生理特性的不同而产生不同的代谢产物。因此，检查微生物的代谢产物，可以用来鉴别不同的微生物。在培养基中检查微生物是否形成有机酸、酒精、气体与类似的物质；能否与解色氨酸产生吲哚；是否产生色素或其他物质，如抗生素等。
◆ 酶：产酶的种类何反应特性等。
◆ 对药物的敏感性
（三）血清学反应
有时确定微生物的种，尤其是亚种，仅依据形态、生理生化等特征很难区别开。因此，常借助于血清学反应。
在微生物分类鉴定中，应用血清学反应的基本原理，是用已知菌种、型或菌株制成抗血清，然后根据它们与待鉴定微生物是否发生特异性的血清学反应，来确定未知菌种、型或菌株。
血清学反应的方法同样可应用于病毒的分类，尤其是应用于噬菌体的分类，具有良好的效果。一般噬菌体都是良好的抗原，把它注射到动物体内可以产生特异性抗体。噬菌体和抗体间的反应和其他常见的抗原抗体反应相似。
现代分类鉴定方法
（一）微生物遗传型的鉴定
◆ DNA碱基比例的测定：（G+C）mol%，DNA分子中G和C所占的摩尔百分比。
◆ 核酸分子杂交法：按照碱基的互补配对原理，用人工方法对两条不同来源的单链核酸进行复性，以构建新的杂合双链核酸技术。
◆ 16SrRNA寡核苷酸编目分析
◆ 微生物全基因组序列测定
（二）细胞化学成分的鉴定
◆ 细胞壁的化学成分：主要是肽聚糖的基本结构
◆ 全细胞水解液的糖型
◆ 磷酸类脂成分的分析
◆ 枝菌酸的分析
◆ 醌类的分析
◆ 气相色谱技术的应用
数值分类法
数值分类法：依据数值分析的原理，借助现代电子计算机技术对拟分类的微生物对象按大量表型性状的相似程度进行统计、归类的方法。
步骤：
◆ 确定分类单元和选择分类特征；
◆ 进行特征测定或从文献中收集有关OUT（操作分类单位）的各项特征资料；
◆ 根据所编制的计算机程序要求，将特征资料进行编码、标准化并输入计算机；
◆ 由计算机计算各OUT之间的相似性，并根据相似性的数值进行聚类分析、分群归类；
◆ 输出分类结果、常用树状谱图法表示。
数值分类法是根据生物表型特征总的相似性分类，其分类结构的表示是一种表型关系，并不直接表示生物的系统发育。其分类结果可作为建立或修改传统分类单元的依据。该分类方法使生物分类从传统分类的定性描述发展到了进行定量分析的水平，其主要目的是建立一种客观的分类方法，并实现分类过程的自动化。
案例
16SrDNA方法鉴定细菌种属
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。5SrRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。而16SrRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
1.16SrRNA普遍存在于原核生物中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。
2.在 16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
3.16SrRNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。
4.可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。
方法：
（一）细菌基因组DNA提取
1.挑单菌落接种到10mLLB培养基中37℃振荡过夜培养。
2.取2mL培养液到2mLEppendorf管中，8000rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3.加140μLTE打散细菌，再加入60μL10mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。
4.加入400μLDigestion Buffer，混匀。再加入3μLProtein K，混匀，55℃温育5分钟。
5.加入260μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6.加入500μL70％乙醇（Wash Solution），10000rpm离心0.5分钟。
7.重复第六步。
8.再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。
9.加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。
10.电泳。取3μL溶液电泳检测质量。
（二）PCR扩增
1.根据已发表的16SrDNA序列设计保守的扩增引物。16S (F)5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
16S (R)5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2.PCR扩增体系：在0.2mL Eppendorf管中加入1μLDNA，再加入以下反应混合液：16S (F)1μL(10μM)16S (R)1μL (10μM)10×PCR BufferdNTP 4μLTaq酶0.5μL加ddH2O
使反应体系调至50μL，简单离心混匀。
3.PCR反应:将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为：94℃3min94℃ 30sec 50℃45sec 35 cycles序列比对72℃ 100sec 72℃ 7 min
4.PCR产物的电泳检测: 拿出Eppendorf管，从中取出5μL反应产物，加入1μL上样缓冲液，再加入4ul的ddH2O混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳1hr。在紫外灯下检测扩增结果。
（三）扩增片段的回收
根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。
1.称量一2mL的Eppendorf管质量，记录。
2.在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2mL的Eppendorf管内，称量。计算凝胶质量。
3.每100mg凝胶加入100μL Binding Buffer，混匀。60℃温育至凝胶融化。
4.全部转入UNIQ-10柱中。10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
5.加入500μLBinding Buffer，10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6.加入70％乙醇（Wash Solution），10000rpm离心0.5分钟。
7.再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。
8.加入30μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000rpm离心2分钟，流下的液体即 为回收的DNA片段。
（四）DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16SPCR引物。
