知识扩展：

溶栓之道——链激酶的发现

                     亲和层析法制备谷胱甘肽S-转移酶(GST)

GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用。

解毒原理：GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽（GSH）的亲核基团GS-反应，中和它们的亲电部位，使产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。

亲和层析利用GST和其底物GSH的特异性结合来进行GST的分离纯化。

所需试剂

缓冲液A：0.025 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3 mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1 mmol/L EDTA，0.2mol/L NaCl

缓冲液B：0.025 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L GSH，2mmol/LDTTn

注：根据酶的性质在分离纯化过程中需要加入适量的金属鳌合剂、还原剂等，以保持酶的活性。

实验步骤

1. 亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备：

  Sepharose 4B在碱性条件下，加入环氧氯丙烷和二氧六环活化将GSH偶联到载体上，制成专一吸附剂。

2. 亲和层析柱的准备：

  装柱:柱床体积约4-6 mL（柱高约2-3 cm），连接蛋白监测系统，用BufferA平衡（约10-20 mL），至记录仪基线平稳。

3. 上柱样品的准备：

(1) 按照两组4 g兔肝，剪碎，加入约10倍组织重的Buffer A，用组织捣碎机匀浆。

(2) 匀浆液先用低速离心机离心10 min，弃沉淀，上清再次离心   （4℃，100000 g，40 min），弃沉淀，滤纸过滤上清液。

4.       3.亲和层析柱分离GST

         （1）上柱：将滤液上柱，流速约   4-5秒1滴。

          (2)平衡：用Buffer A洗去杂蛋白至柱中介质变白，记录仪回到基线

          (3)洗脱：用Buffer B洗脱，流速约4-5秒1滴，收集洗脱峰(约5mL)分装冷冻。

课堂活动：分析图谱信息