知识结构图

内容

三个经典实验-----“核内”遗传物质证明实验

肺炎链球菌的转化实验

1928年英国医生F.Griffith首次发现转化现象。少量的R型与大量加热杀死的S型细胞混合注射到小白 鼠体中，白鼠病死，在其尸体内发现有活的S型细胞。此实验说明，加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。

1944年，Avery等人从热死的S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化实验。

从活的S菌中抽提各种细胞成分 DNA，RNA，蛋白质，荚膜多糖等。并对各组分进行转化试验。

结果表明，只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。而且DNA纯度越高，转化效率也越高。只取微量纯DNA(6×10-8g)，仍有转化能力。这就说明S型菌株转移给R型菌株的，决不是某一遗传性状(如荚膜多糖)本身，而是以DNA为物质基础的遗传因子。

噬菌体的感染实验

1952年A.D.Hershey和M.Chase将E.coli培养在以放射性32PO43-或35SO42-作为磷源或硫源的合成培养基中。结果，可以获得含32P-DNA(噬菌体核心)的噬菌体或含35S-蛋白质(噬菌体外壳)的两种实验用噬菌体，在噬菌体的感染过程中，其蛋白质外壳未进入宿主细胞 。进入宿主细胞的DNA经增殖、装配后，能产生一大群既有DNA核心又有蛋白质外壳的完整噬菌体颗粒。这就有力地证明在其DNA中，含有包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。通过电子显微镜的观察也证实了这个论点。

烟草花叶病毒的重建实验

H.Fraenkel-Conrat(1956年)用含RNA的烟草花叶病毒进行了著名的植物病毒重建实验。把TMV放在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将它的蛋白质外壳与RNA核相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。但由于RNA是裸露的，所以感染频率较低。在实验中，还选用了另一株与TMV近缘的霍氏车前花叶病(HRV,Holmes ribgrass mosaic virus)。

当用TMV的RNA与HRV的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草时, 烟叶上出现的是典型的TMV病斑，从中分离出来的新病毒也是典型的TMV病毒。反之，用HRV的RNA与 TMV的蛋白质外壳进行重建时,也可获得相同的结论。这就充分说明，核酸(这里为RNA)是病毒 的遗传物质。

三个经典实验有力证明：只有核酸才是贮存遗传信息的真正物质。

案例

细菌质粒DNA的微量制备

质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生型的自主复制子。

大肠杆菌染色体DNA比通常用作载体的质粒DNA分子大得多，在提取得过程中，染色体DNA易断裂成线性DNA分子，而大多数质粒DNA则是共价闭环型，根据这一差异便可以设计出各种分离、提纯质粒DNA的方法。    

在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等等。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。

由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。

准备：LB 液体培养基、TEG缓冲液（溶液I）、碱裂解液(溶液II)、乙酸钾溶液（溶液III）、酚／氯仿（1：1）溶液配制、无水乙醇及70％乙醇、TE缓冲液(10mmol/L, pH8.0 Tris-HCl, 1mmol/L EDTA)、携带质粒的大肠杆菌、Eppendorf管、恒温振荡器、台式离心机等

方法：

1）培养细菌扩增质粒

将携带质粒的大肠杆菌接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。

2）收集菌体和裂解细菌

（1）取1.5mL培养液置Eppendorf管内，离心，5000r/min，5min，弃去上清，保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，收集菌体。

（2）将菌体沉淀悬浮于预冷的100μl溶液I，剧烈振荡、混匀，室温放置10min。

（3）加入200μl新鲜配制的溶液II，加盖，颠倒数次轻轻混匀，放置5min。

3）分离纯化质粒DNA

（1）加入150μl冷却的溶液III。加盖后，温和颠倒数次混匀，放置15min。

（2）4℃下离心，5000r/min, 5min，乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并使过量的SDS－Na＋转化为溶解度很低的SDS－K＋一起沉淀下来。离心后，上清液若仍混浊，应混匀后再冷至0℃，重复离心。上清液转移至另一干净的Eppendorf管内。

（3）加入等体积的酚，反复振荡，离心，12000r/min, 5min, 小心吸取上层水相溶液，转移到另一个Eppendorf管中。

（4）加入等体积24：1的氯仿／异戊醇混合液，反复振荡，离心，12000r/min, 5min, 小心吸取上层水相溶液，转移到另一个Eppendorf管中

（5）上述溶液中加入两倍体积的预冷无水乙醇，混合摇匀，放置10min。4℃下离心，5000r/min , 5min, 弃去上清液，并将Eppendorf管倒置在干滤纸上，空干管壁粘附的溶液。

（6）加入1mL 70％冷乙醇，洗涤沉淀物，离心，弃去上清液，尽可能除净管壁上的液珠，放置干燥或真空干燥，即得质粒DNA制品。

（7）将DNA沉淀溶于50μlTE缓冲液（临用前加入20μg/mLRNaseA），置－20℃保存，备用

练习